原生质体是组成细胞的一个形态结构单位, 原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”, 是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体, Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液, 在一定条件下培养一段时间后, 发现大部分细胞的细胞壁被降解, 从而制备出大量有活力的原生质体。
1、原生质体融合的目的及意义
原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力, 使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合, 进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞, 克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。另外, 可转移优良的生物性状, 实现基因重组, 而改良现有品种。目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等, 还可按照人们预先的期望创造出新物种。
2、原生质体的融合方法
2.1、自发融合
在酶解细胞壁形成原生质体的过程中, 相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体 (homokaryon) 。每个同核体内可包含两个或多个核, 这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中, 大约有50%是多核融合体。
2.2、高p H-高Ca2+法
通常情况下, Ca2+影响细胞融合的效率比Na+和K+要低, 但是在高p H环境下, 高浓度的Ca2+影响细胞融合的效率大大升高。该法以钙盐作诱导剂, 在高Ca2+高p H的条件下, 使原生质体发生融合。该种方法在1973年是由Keller和Melchers进行诱导烟草原生质体融合时创造的。具体是将两个原生质体的混合物放于含有7.35 g/L Ca Cl2·2H2O和72.87 g/L甘露醇的溶液中, p H值为10.5, 在200 rpm/min低速下离心3 min, 然后将离心管保持在37℃水浴锅中40~50 min。但这种方法仅适合叶肉原生质体的融合, 并且要注意高p H环境对某些细胞生理活性产生的影响。
2.3、聚乙二醇 (PEG) 法
PEG是一种大分子量的水溶性多聚化合物。采用PEG法, 需将两种不同的原生质体以合适比例混合后, 加入28%~58%的PEG溶液处理15~30 min, 然后用培养基进行清洗后即可培养。后来有学者对PEG法进行了改进, 即逐步降低PEG的浓度, 提高溶液中Ca2+的浓度和p H值, 使融合效果得到有效的提高。由于该法易于控制、操作简单、促进细胞融合的能力较强、诱导的融合没有特异性, 故被广泛选用。
2.4、电融合法
电融合法是指用细胞融合仪产生交变电压和高压脉冲电场, 使粘连的原生质体膜瞬间破裂, 然后与相邻的不同原生质体连接闭合产生融合体。黄家总等成功地利用电击细胞融合, 使紫罗兰和桂竹香的原生质体融合。该种方法的优点是没有化学残留、对细胞的毒害作用较小、操作简单、融合率高、一次可融合大量原生质体。
2.5、激光微束穿刺法
激光微束穿刺法是利用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺, 引起细胞膜的可逆性穿孔, 从而导入外源DNA的一种基因直接转化方法。侯丙凯等首次用激光微束穿刺法照射油菜子叶叶柄, 将杀虫蛋白基因导入油菜, 经植物再生和卡那霉素筛选, 成功获得了抗虫转基因植株。此法对细胞的损伤较小, 并且可以准确定位于被照射的细胞, 但是因设备昂贵, 故在大量培养生产中使用较少。
2.6、亚原生质体融合
植物亚原生质体主要包括3种, 分别是核质体、胞质体和微原生质体, 其中最常用的是胞质体和微原生质体。胞质体-原生质体融合被认为是获得胞质杂种、转移胞质因子最为有效的方法。如Sigareva等将大白菜原生质体与抗寒且具有Ogura型CMS特性的花椰菜胞质体融合, 获得的胞质杂种具有抗寒与胞质雄性不育的特性, 与传统方法相比, 此法育种过程较短, 生产效率更高。另外, 微原生质体-原生质体融合也被称为微核技术, 是指将供体原生质体经处理后仅含有一条或几条染色体, 用膜包被后与另一完整原生质体融合的技术。Ramulu等利用该技术在茄科不同属植物间完成了目标染色体的转移, 并成功获得植株。该技术虽可在不同种属间转移一条或多条染色体, 并获得性状稳定的再生植株, 但制备微原生质体的难度较大, 因此该技术在实际应用中具有一定的局限性。
3、展望
除上述植物原生质体融合方法外, 还包括植物介导的遗传转化法、盐类融合法、多聚化合物法、PEG-高Ca2+-高p H融合法, 目前发展的如高通量细胞融合芯片方法和基于微流控芯片进行融合法。关于对植物原生质体融合方法的研究, 是许多学者的研究对象, 相信将来如果在原生质体融合效率和成本控制、多个原生质体间的融合与如何将优良性状基因精准地导入植物细胞融合方面取得进展, 植物原生质体融合会起到更加重要的作用, 创造更大的价值。
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