Abstract：Aflatoxins contamination is a major reason that threatens the safety of peanut, corn, wheat and their products.According to physicochemical properties, aflatoxins can be removed by physical, chemical, or biological methods.This paper reviewed the major methods of removing aflatoxins to provide a reference for ensuring the safety of crops and their products.
Keyword：aflatoxins;removal;safety;
黄曲霉毒素 (aflatoxin, AFT) 是由黄曲霉 (Asper gillus flavus) 和寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus) 等真菌产生的一类带有香豆素和双呋喃环的毒性代谢产物。目前已经鉴定出的黄曲霉毒素有20多种, 其中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2 (结构见图1) 为四种最常见的黄曲霉毒素, 而AFB1是食物中最常见的。另外, AFB1的代谢产物黄曲霉毒素M1主要存在于动物组织和体液中, 如牛奶和尿液, M1也是人们关注较多的一类黄曲霉毒素[1]。由于黄曲霉毒素具有极强的毒性, 并且普遍存在于花生、玉米、小麦等大宗农产品中, 因此如何脱除黄曲霉毒素已经成为了各国科研人员的研究热点。本文对目前比较重要的黄曲霉毒素的脱除方法进行了综述, 以期为上述农产品的安全生产提供参考。
图1 四种黄曲霉毒素的结构式
1、黄曲霉毒素的理化性质
黄曲霉毒素易溶于乙腈、甲醇、氯仿、二甲基亚砜等有机溶剂, 微溶于水, 不溶于乙醚、石油醚和正己烷等[2]。黄曲霉毒素在酸性条件下比较稳定, 在碱性条件下其内酯环被破坏而生成水溶性的香豆素盐。黄曲霉毒素对热稳定, 在100℃下加热20 h也不被破坏, 只有在268℃以上的高温下才裂解, 一般的烹调过程对黄曲霉毒素的结构没有影响[3]。
2、黄曲霉毒素的毒性及危害
黄曲霉毒素广泛存在于花生、玉米、小麦、大米等农产品中, 这些农产品在高热高湿环境下较易累积黄曲霉毒素。国际癌症研究机构于1993年将黄曲霉毒素划定为I类致癌物, 其中AFB1被公认为致癌力最强的物质。黄曲霉毒素在体内主要分布在肝脏中人体长期摄入含有黄曲霉毒素的食物容易患肝癌, 并对其它多种组织器官也能造成严重损害[4]。此外, 黄曲霉毒素还具有致畸、致突变等作用[5]。AFB1的毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍、三聚氰胺的416倍;黄曲霉毒素的致癌力是二甲基亚硝胺的70倍、六氯联苯 (BHC) 的10000倍[1,6]。
3、黄曲霉毒素的限量标准
黄曲霉毒素危害性大、分布广泛、难去除, 因此为了预防黄曲霉毒素中毒事件的发生, 很多国家和地区都对农产品和食品中的黄曲霉毒素的含量作出了限量要求。如欧盟规定AFB1的最高限量为2μg/kg花生、坚果、果脯和谷物中 (AFB1+AFB2+AFG1+AFG2) 的总量为4μg/kg[1]。我国GB2761-2011《食品中真菌毒素限量》规定了食品中AFB1的限量标准:玉米及玉米制品、花生及其制品不得超过20μg/kg;稻谷、糙米、大米、植物油脂 (花生油、玉米油除外) 不得超过10μg/kg;其它粮食、豆类、发酵食品和婴儿配方食品不得超过5μg/kg。
4、黄曲霉毒素的去除技术
霉菌生长对环境要求不高, 农产品在种植、贮运及加工等环节中均可能被污染而积累黄曲霉毒素。农产品一旦被黄曲霉毒素污染, 就必须经过脱毒才能用于食品或饲料生产。常用的黄曲霉毒素去除方法可分为物理法、化学法和生物法[7]。
4.1、物理方法
去除黄曲霉毒素的物理方法主要有水洗法、挑除法、吸附法、加热去毒法、辐射法等。
对于易溶于水的霉菌毒素往往可采用温热盐水浸泡法, 这是一种经济安全的好方法, 但黄曲霉毒素不溶于水并且对热稳定, 因此水洗法对黄曲霉毒素的脱除效果并不理想[8]。另外, 黄曲霉毒素在玉米和花生等农作物中分布很不均匀, 所以用水洗和挑除法很难去除大部分黄曲霉毒素[9]。
张国辉等在饲料中加入水合铝硅酸钠钙、沸石、膨润土、活性碳等可以吸附大部分黄曲霉毒素, 甚至接近不含黄曲霉毒素饲料的水平[10]。叶盛群等考察了两种不同来源霉菌毒素吸附剂对黄曲霉毒素的吸附效果, 发现两种霉菌毒素吸附剂在体外对AFB1均有较好的吸附效果;在体内均能有效降低牛乳中黄曲霉毒素M1的含量, 并能提高奶牛产奶量, 且对乳品质无明显影响[11]。
黄达明等研究指出, 加热可以降低花生中黄曲霉毒素的水平, 并且脱除效果随着加热温度和加热时间的增加而提高;黄曲霉毒素含量的降低速率与样品初始的黄曲霉毒素水平有关[12]。Gomaa等研究发现在高温高压下处理黄曲霉毒素的效果明显好于常温常压[13]。
由于AFB1广泛存在于污染的食品和饲料中, 世界卫生组织已将控制食品中AFB1污染作为全球公共卫生管理的重要目标。电离辐射技术是一种能有效降解食品中AFB1的新型技术。
用大剂量高压汞灯紫外线照射发霉的饲料能去除97%~99%的黄曲霉毒素, γ-射线的常用照射剂量为3~5 k Gy/h[7,8]。花生油中2 mg/kg的AFB1在800?w/cm2×30 min紫外照射剂量下可以完全降解, 除了使花生油过氧化值显着增加 (在国标范围内) 外, 花生油酸价、碘价、羰基值、维生素E及反式脂肪酸等微量成分并无明显变化, 说明所选照射剂量对花生油成分的结构没有损伤, 且未使油脂发生酸败等变质反应[14]。
采用60Co射线辐照源进行辐照能有效降解甲醇-水溶液 (v/v, 60:40) 中的AFB1, AFB1的降解率与辐射剂量呈正相关, 0.1 mg/L的AFB1溶液在4 kGy时降解率达到82.4%, 6 kGy时降解率则高达96.3%。研究还表明, AFB1初始浓度越低越容易降解, 0.1 mg/L的AFB1溶液在3 kGy时的降解率与10 mg/L的AFB1在6 kGy时的降解率均为58.8%[15]。
等离子体法是近几年来兴起的一种黄曲霉毒素脱毒方法。董晓娜等对等离子体在AFB1脱毒中的应用进行了研究。结果发现, 在作用功率200 W、作用时间80 s和极距3 cm条件下, AFB1降解率可达51.67%[16]。
4.2、化学方法
由于黄曲霉毒素对碱不稳定, 因此可用碱炼法降低黄曲霉毒素的含量。NaOH溶液能迅速水解黄曲霉毒素, 反应生成邻位香豆素钠盐, 这种钠盐能溶于水, 可用水洗去除。用1%NaOH水溶液处理含有黄曲霉毒素的花生饼1 d, 可使毒素由84.9?g/kg降至27.6?g/kg。1份被污染饲料, 用2份1%NaOH溶液浸泡, 煮沸1~2 h后即可用于饲喂[7]。
盖云霞研究发现弱碱高温处理能有效去除原料中的黄曲霉毒素, 花生粕经过121℃、pH10处理60min后, 黄曲霉毒素的降解率高达84.5%[17]。
氨能够同AFB1发生脱羟基作用, 因此可用氨处理法脱除黄曲霉毒素。将霉菌污染的饲料加氨后用塑料薄膜密封, 导致AFB1的内酯环发生裂解, 从而达到脱毒目的。梁俊平研究采用氨气熏蒸法降解花生及其制品中的黄曲霉毒素, 当采用7%氨气熏蒸含水量25%的花生, 在40℃下处理48 h时, AFB1的降解率为83.5%[18]。
臭氧熏蒸法是基于物理和化学氧化双重作用的脱毒方法。罗建伟等将污染了AFB1的谷物放入熏蒸柜中, 循环通入臭氧, 熏蒸9 h, 结果显示AFB1去除率可达90%以上;同一粮种, 低水分粮食的去毒效果比高水分粮好;AFB1在臭氧处理的最初1~2 h时去除速度最快, 毒素含量可下降80%以上。臭氧处理法是一种具有实际应用前景的粮食黄曲霉毒素脱毒方法[19]。
4.3、生物方法
很多微生物能够产生降解黄曲霉毒素的酶, 因此可用相应的微生物及其酶制剂来脱除黄曲霉毒素。目前已分离鉴定出了大量具有黄曲霉毒素降解作用的微生物或酶。利用生物学方法降解黄曲毒毒素是目前研究的热点之一。
橙色黄杆菌 (Flavobacterium aurantiacum) 的粗提液在p H7下能够降解22%~45%的AFB1, 用蛋白激酶K和DNase-I处理粗提取液后再进行AFB1降解试验, 结果表明该降解作用是通过酶来实现的[20]。Hormisch发现从土壤中分离的分支杆菌 (Mycobacterium fluoranthenivorans) DSM44556T能有效地降解黄曲霉毒素, 36 h后能去除20%~30%的AFB1;72 h后则检测不到AFB1[21]。Teniola等利用该菌的无细胞提取物与AFB1在30℃下反应4 h后, AFB1降解率达到90%以上, 8 h后完全检测不到AFB1[22]。
Motomura等从糙皮侧耳 (Pleurotus ostreatus) 中提取并纯化了1种胞外酶通过TLC检测发现这种胞外酶几乎能完全降解AFB1。荧光检测表明AFB1经此酶作用后, 其荧光强度明显降低, 说明该酶可破坏AFB1的苯环[23]。Liu等从假密环菌 (Armillariella tabescens) 中分离纯化得到一种黄曲霉毒素脱毒酶, 在pH6.8、35℃保持最佳酶活, 可使样品中的AFB1减少80%[24]。Alberts等人从红串红球菌 (Rhodococcus crythropolis) 的液体培养物中分离出1种胞外提取物, AFB1经这种胞外提取物作用72 h后, AFB1残留率达33.2%[25]。
曾凡正等从一种具有AFB1降解活性菌株的发酵液中提取粗酶, 并将这种酶反应引入到花生油的精炼工艺中。以添加AFB1含量为100?g/kg的花生毛油为试验对象, 添加一定量的粗酶液、0.025%Na OH和600 mg/kg磷脂酶A1后, 40℃下反应时间4 h, AFB1去除率高达81%, 去毒后花生油的脱胶效果也达到精炼要求[26]。李俊霞等人以香豆素为惟一碳源和能源进行AFB1降解菌株的初筛, 最终筛选出的NMO-3菌株降解AFB1的能力达85.7%, 经形态、生理生化反应以及16S r DNA序列比对等方面分析, 最终确定此菌为嗜麦窄食单胞菌 (Stenotrophomonas sp.) , 活菌制剂在2.56×1010 cfu/m L剂量以下不会引起急性中毒反应[27]。Guan等也发现嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia) 能降解82.5%AFB1, 且降解率受温度和p H的影响, Zn2+和蛋白激酶能抑制毒素降解反应, 推测该菌降解毒素的成分为酶[28]。王宁等从灰叶猴粪便中分离得到一株对AFB1有降解作用的橙红色粘球菌 (Myxococcus fulvus) , 并对菌株培养基组成和发酵产酶条件进行优化, 在最佳发酵条件下, 对AFB1的降解率达到78.2%[29]。从花生土壤和花生粕中分离得到的巨大芽袍杆菌 (Bacillus megaterium) 也能降解AFB1, 其最佳脱除率可达69.34%[30]。王会娟筛选到高产漆酶的菌株平菇P1, 将平菇P1发酵液与AFB1振荡混匀后, 30℃下静置孵育72 h, AFB1可以被降解76.13%;延长孵育时间, AFB1降解率可达到91.80%[31]。
除了上述菌株外, 益生菌在黄曲霉毒素脱除中的应用也吸引了部分学者的关注。刘畅研究发现益生菌活菌能有效吸附培养基中的AFB1, 经热处理的灭活菌体对AFB1的吸附能力显着提高[32]。污染了AFB1的花生粕经乳酸菌30℃厌氧培养72 h, AFB1的降解率达99.4%;经酵母菌30℃培养72 h, AFB1的降解率达83.4%。乳酸菌的处理效果显着优于酵母菌的处理效果[33]。
5、小结
传统的水洗法、挑除法、吸附法和加热去毒法等物理方法都存在一些问题, 如黄曲霉毒素去除不完全, 并导致农产品中的营养损失, 甚至影响其感官品质;传统的化学方法有些需要先进的设备, 并且去除方法的反应机制是可逆的, 黄曲霉毒素会恢复毒性这些都限制了其在实际生产中的应用。辐照法和生物脱毒法是具有发展前景的方法, 这些方法处理条件简单, 适合工业化生产, 而且不会破坏产品品质, 目前已受到广泛关注。
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