1、引言
疯草(locoweed)是含苦马豆素(Swainsonine,SW)的棘豆属(Oxytropis glabra DC.)和黄芪属(Astraga-lus)有毒植物的统称[1]。SW是一种吲哚兹定生物碱,抑制动物细胞α-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2],引起低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍,导致细胞和组织器官功能紊乱。家畜过量采食含有SW的疯草发生中毒,出现四肢麻痹、食欲不振、体重减少、流产等,严 重 者 死 亡,为 畜 牧 业 带 来 了 极 大 的 经 济 损失[3~5]。近年来对疯草内生真菌SW的研究越来越深入,已经初步研究出SW在植物和疯草内生真菌中的合成机制,推测出SW合成部分途径,其详细未知。SW有良好的抗肿瘤和免疫调节活性,利用真菌合成有望提高SW的提取率[6]。
人工合成苦马豆素
2、SW的性质、作用机理及提取检测
2.1、SW来源及其理化性质
1979年Colegate等首次从灰苦马豆中分离出有毒的三羟基吲哚兹定生物碱-SW[3],SW化学式为C8H15NO3,分子量为173,熔点144 ℃~145 ℃,pKa为7.4,其纯品为白色针状晶体,易溶于水,不溶于乙醚、氯仿、和丙酮等有机溶剂。
1982年美国学者Molyneux从 美国疯草中分离得到SW,认为在美国牲畜疯草中毒主要由SW引起[7]。1989年我国学者曹光荣从黄花棘豆中分离得到SW[8],2003年Braun等从美国斑荚膜黄芪(Astragalus mollissimus)、蓝伯氏棘豆(Oxytropis Lam-bertii)和绢毛棘豆(Oxytropis sericea)三种疯草中培养出埃里砖格孢属内生真菌(Embellisia sp.L12,),并从该内 生 真 菌 中 分 离 出SW[9]。 卢 萍 等 从 小 花 棘 豆(Oxytropis glabra))、刺叶柄棘豆(Oxytropis aciphylla)和砂珍棘豆(Oxytropis racemosa)单株植物中提取SW,发现只有小花棘豆含SW,并植株体外分离得到内生真菌,通过微生物学特征和5.8SrDNA/ITS序列测序鉴定该内生真菌为Embellisia,后修订为Alternaria,而不含SW的小花棘豆都没有内生真菌,体内有内生真菌的小花棘豆产生SW,提出小花棘豆的SW由内生真菌合成[10,11]。此外,余永涛、王建华、路浩等从甘肃棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪、青海疯草中分离出了SW。另外,Schneider等从豆类丝核菌、Hino等从金龟子绿僵菌中也分离到SW。
2.2、SW的机理
SW引起动物疯草病,它特异性抑制细胞溶酶体-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ的活性,使甘露糖苷酶与甘露糖的结合受阻,甘露糖蛋白代谢异常,引起神经细胞的功能的紊乱,导致细胞空泡化,从而牲畜出现中毒症状,主要对牲畜中枢神经系统、内脏及骨骼肌等组织细胞造成严重损伤,牲畜中毒给草原畜牧业带来重大损失[3~5]。SW有抗肿瘤活性,能抑制肿瘤细胞的生长和转移,并提高机体免疫功能,使NK细胞和LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力显着增强[6]。
2.3、SW的提取和检测方法
1979年Colegate等利用乙酸乙酯索氏提取法首次提取到SW,溶液经阳离子交换柱层析,用氨水洗脱,收集浓缩后用氯化钠梯度洗脱,氨水-氯仿抽提,回收后重结晶后得SW[3]。我国学者曹光荣从黄花棘豆中分离到SW,用盐酸浸泡植物样品粉末,滤液过离子交换柱层析,洗脱得SW[8]。卢萍等从小花棘豆内生真菌中提取,利用乙酸-氯仿萃取、阳离子交换层析纯化得SW。目前检测SW方法主要有薄层色谱法、气相色谱法及气相色谱-质谱联用法、液相色谱法及液相色谱-质谱联用法、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法等。
薄层色谱技术用于快速分离和定性分析未知化合物。SW是三羟基生物碱,对常规生物碱显色剂反应不灵敏、不易观察其颜色,可用Erilich′s试剂显色法,将检测样品氧化后用醋酸酐处理加热发生脱水反应,形成不饱和键,与Erilich′s试剂结合后生成便于观察的紫红色物质[12]。气相色谱法流动相为气体,分离效率较高、分析速度较快、消耗样品量少、应用广泛。保留时间是指被测样品从进样至最大浓度值出现所需时间,依据保留时间出峰值位置进行定性分析,依据保留时间峰面积进行定量分析[13]。因为SW在高温下分解,不能使用常规气相色谱技术检测,需在进样前进行甲基化衍生反应,使之在高温下稳定后再检测。
高效液相色谱法以液体为流动相,灵敏度高、高效高速、定量准确,与气相色谱法基本原理方面相同,区别在于流动相为液体,调整流动相配较繁琐,对层析柱要求较高[13],用此法测定SW的优点是无需进行甲基化衍生。气相色谱和液相色谱均能与质谱联用,进行SW定性定量分析。α-甘露糖苷酶活性抑制分析法属于酶标分析法,α-甘露糖苷酶降解底物甘露糖苷,由于SW阳离子结构与甘露糖苷阳离子结构相似,SW与甘露糖苷酶亲和力高,从而妨碍α-甘露糖苷酶与底物的结合,该原理可间接测定SW含量[14]。卢萍课题组分别用气相-质谱联用法、液相-质谱联用法、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法测定了小花棘豆内生真菌中SW的含量,重复性良好。
3、真菌SW生物合成途径
3.1、豆类丝核菌的SW合成途径
Broquist等从豆类丝核菌中分离出SW,该真菌可合成根霉菌胺及SW两种生物碱[15]。Harris等推测豆类丝核菌中赖氨酸合成哌啶酸途径:赖氨酸→酵母氨酸→L-2-氨 基 己 二 酸 半 醛→1,6-二 六 氢 吡 啶 羧 酸(△1-piperideine-6–carboxylate,P6C)→哌 啶 酸[16]。Wickwire等提出P6C为哌啶酸的直接前体物,哌啶酸是SW的前体物,并推测出哌啶酸的合成途径为L-赖氨酸→酵母氨酸→P6C→吡啶酸:在酵母氨酸还原酶作用下赖氨酸形成酵母氨酸,在酵母氨酸还原酶作用下酵母氨酸形成L-2-氨基己二酸半醛,发生构型改变生成P6C,1,6-二六氢哌啶酸还原酶作用下生成哌啶酸,与丙二酸反应生成乙二酸哌啶,还原环化生成1-羧基吲哚里西啶,还原羟化生成1,2,8-三羟基吲哚里西啶,即SW[17]。
3.2、金龟子绿僵菌SW合成途径
金龟子绿僵菌是昆虫病原真菌,Sim等对金龟子绿僵菌合成SW机理进行研究,发现培养基中添加L-赖氨酸可增加哌啶酸的产量;添加赖氨酸相似物AEC时SW含量减少,酵母氨酸含量增多,菌体内大量酵母氨酸转变为赖氨酸,认为L-赖氨酸是哌啶酸的前体。推测SW生物合成时,L-赖氨酸在酵母氨酸还原酶作用下生成酵母氨酸,然后酵母氨酸在酵母氨酸氧化酶作用下,生成哌啶酸或α-酮戊二酸,经一系列反应生成α-氨基已二酸半醛,再通过非酶促环化反应形成哌啶酸,最后转化为SW[18]。
3.3、疯草内生真菌SW合成途径
Mukhejee等敲除疯草Undifilum内生真菌的酵母氨酸还原酶基因,发现突变株中酵母氨酸和赖氨酸含量减少,而哌啶酸和SW含量增多,鉴于P6C是哌啶酸的直接前体,哌啶酸是SW的前体,推测SW生物合成途径是:α-氨基己二酸→α-氨基己二酸半醛→P6C→哌啶酸→SW;同时,α-氨基己二酸半醛→酵母氨酸→赖氨酸,P6C与酵母氨酸之间可相互转换[19]。卢萍课题组克隆了小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因cDNA全长序列(KJ944635)和该基因完整序列(KY052048),构建酵母氨酸还原酶基因缺失突变株。
在固体培养基中添加α-氨基己二酸、L-赖氨酸和哌啶酸三种前体物,培养内生真菌野生株和突变株,发现野生株的SW含量高于突变株;野生株中酵母氨酸含量比突变株高,而赖氨酸含量变化不明显,赖氨酸促进SW的合成;推测赖氨酸是生物体必需氨基酸,酵母氨酸是赖氨酸合成代谢途径中间产物,酵母氨酸还原酶基因缺失后,突变株中酵母氨酸的合成受阻,可能从逆反应方向进行,即在酵母氨酸氧化酶的作用下由P6C转化为酵母氨酸,然后生成赖氨酸,维持机体正常的生命活动,而P6C是SW合成前体,故突变株中SW的含量降低,而赖氨酸含量保持不变。添加前体化合物均可提高SW含量,其中哌啶酸对SW含量影响最大。
近期研究推测疯草内生真菌SW生物合成途径有P6C途径和P2C途径[20,21]。在P6C途径中,L-赖氨酸→酵母氨酸→α-氨基己二酸半醛→P6C,酵母氨酸还原酶催化以上三步反应,P6C在吡咯啉-5-羧酸还原酶作用下生成哌啶酸,然后聚酮合酶催化其生成1-酮基-吲哚里西啶,再经P450家族酶催化生成SW;P2C途径是新近推测出的另一条SW生物合成途径,由L-赖氨酸→α-己酮酸→P2C→哌啶酸→1-酮基-吲哚里西啶→SW,无论是P6C还是P2C,都有许多未解之谜,需深入研究。
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