Abstract：To establish the efficient regeneration system and lay foundation for transgenic system of Sedum plumbizincicola in this research, the young leaves of S. plumbizincicola as explants, several factors affecting callus induction, bud differentiation, and plant regeneration were studied, and then a regeneration system was established. An MS medium supplemented with 300 mg·L-1 hydrolyzed casein was used as the basic medium.Different concentrations of hormone combinations was designed. Results showed that the best medium for leaf callus induction was the basic medium with 1.00 mg·L-1 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) and 0.30 mg·L-1 6-Benzylaminopurine (6-BA) added having a callus induction rate of 92.01%. The best medium for bud differentiation was the basic medium supplemented with 0.10 mg·L-1 2, 4-D and 1.00 mg·L-1 6-BA having a callus differentiation rate of 27.44%. A suitable medium for bud proliferation was the basic medium with 0.10 mg·L-1 2, 4-D and (0.50-1.00) mg·L-1 6-BA added. Also, a suitable rooting medium was the basic medium with 1.00-2.00 mg·L-1 3-indolebutyric acid (IBA) added. These findings laid a tissue culture foundation for the establishment of a transgenic system with S. plumbizincicola. [Ch, 1 fig. 2 tab. 15 ref.]
Keyword：botany; tissue culture; Sedum plumbizincicola; leaf; callus; regeneration system;
伴矿景天Sedum plumbizincicola是景天科Crassulaceae景天属Sedum的新种, 多年生肉质草本, 以无性繁殖为主;适应性广, 生物量大, 生长速度快, 在中国大部分地区均可正常生长[1]。作为一种新的锌、镉超富集植物[2], 目前对伴矿景天重金属耐受和解毒的研究较多, 主要集中在植株对重金属的响应和耐性机制及细胞生理等方面[3-4];对于重金属对蛋白质表达的影响、重金属胁迫下基因的调控及其与信号转导途径的关系等分子机制的研究甚少, 目前, 对伴矿景天再生体系的研究鲜有报道, 伴矿景天再生体系的建立是基因枪法、农杆菌介导法遗传转化的基础, 更是研究其重金属耐受和解毒分子机制、培育优良新品种的重要途径。现以伴矿景天幼嫩叶片为材料, 研究了不同植物生长调节剂组合对伴矿景天再生培养的影响, 以期为建立稳定的遗传转化体系提供良好的受体材料。
1、材料与方法
1.1、试验材料
伴矿景天 (叶片) 来自浙江农林大学农业与食品科学学院人工气候室。基本培养基为添加了300.00mg·L-1水解酪蛋白的MS (Murashige and Skoog) 培养基, 同时添加30.00 g·L-1蔗糖、7.00 g·L-1琼脂, p H5.8。
1.2、试验方法
1.2.1、外植体处理
采集新鲜幼嫩的伴矿景天叶片, 自来水冲洗20 min左右, 转移到超净工作台上操作。用体积分数75.0%的乙醇消毒30 s, 无菌水冲洗1~2次;有效氯质量浓度1.5%的次氯酸钠消毒10min, 无菌水冲洗2~3次, 在无菌滤纸上晾干。
1.2.2、愈伤组织的诱导和增殖培养
将消毒过的叶片切成5 mm×5 mm的大小, 接种至愈伤组织诱导培养基, 40 d后统计愈伤组织诱导率。培养基设置参考吴龙华等[5]进行, 用以研究2, 4-二氯苯氧乙酸 (2, 4-D) 与6-苄基腺嘌呤 (6-BA) , 萘乙酸 (NAA) 与噻苯隆 (TDZ) 的组合对叶片愈伤组织诱导的影响。分别用添加0.30 mg·L-16-BA和不同质量浓度 (0, 1.00, 2.00, 4.00 mg·L-1) 2, 4-D, 添加3.00 mg·L-1 NAA和不同质量浓度 (0, 0.50, 0.70, 1.00 mg·L-1) TDZ的培养基培养叶片。收集诱导长成的愈伤组织并接种于添加0.20 mg·L-12, 4-D和0.05 mg·L-1 TDZ的培养基中继续增殖培养。
1.2.3、愈伤组织分化
愈伤组织增殖培养20 d后, 切成直径约5 mm的小块, 接种于分化培养基, 继续培养30 d后统计分化率。分化培养基添加0.10 mg·L-12, 4-D和不同质量浓度 (0, 0.10, 0.50, 1.00, 2.00 mg·L-1) 6-BA。
1.2.4、芽的增殖培养将生芽的愈伤组织转接于添加0.10 mg·L-1 2, 4-D和不同质量浓度 (0.50, 1.00 mg·L-1) 6-BA的培养基中进行增殖培养。
将生芽的愈伤组织转接于添加0.10 mg·L-1 2, 4-D和不同质量浓度 (0.50, 1.00 mg·L-1) 6-BA的培养基中进行增殖培养。
1.2.5、生根培养
选取增殖良好、长势一致的丛生芽接种于生根培养基中, 30 d后统计生根率。生根培养基添加不同质量浓度 (0, 0.10, 0.50, 1.00, 2.00 mg·L-1) 的吲哚丁酸 (IBA) 。
1.2.6、练苗与移栽
选取高度大于4 cm, 比较粗壮的植株, 在培养室开盖培养1周, 之后取出再生苗用自来水洗净培养基后, 移栽盛有V (蛭石) ∶V (泥炭土) =1∶1混合的穴盘中并加盖保湿, 1周之后开盖。
1.2.7、培养条件
培养温度均为 (25±2) ℃。愈伤组织的诱导和增殖培养在暗培养条件下进行, 芽的诱导、增殖培养和生根诱导在光照强度为3 000 lx, 光照16 h/黑暗8 h条件下培养。
1.3、数据统计分析
实验进行3次生物学重复, 数据用Excel 2007整理, SPSS 17.0分析, Duncan法作方差分析。愈伤组织诱导率= (诱导出愈伤组织的叶片数/接种总叶片数) ×100%, 分化率= (分化出不定芽的愈伤组织数/愈伤组织总数) ×100%, 繁殖系数= (新生芽总数/接种芽数) ×100%, 根诱导率= (出根不定芽数/不定芽总数) ×100%。
2、结果与分析
2.1、2, 4-D与6-BA, NAA与TDZ的组合对愈伤组织诱导的影响
2, 4-D在诱导愈伤组织中起着重要作用。培养基中只添加0.30 mg·L-1 6-BA, 结果发现无愈伤组织产生;在添加2, 4-D的培养基中, 叶片生长10 d左右即开始膨大, 30 d左右开始产生愈伤组织。2, 4-D质量浓度对愈伤组织诱导率有影响, 当2, 4-D质量浓度从1.00 mg·L-1升高到2.00 mg·L-1时, 愈伤组织诱导率从92.01%增加到94.91%, 但差异不显着 (P>0.05) ;当达4.00 mg·L-1时, 愈伤组织诱导率为81.58%, 显着下降 (表1) 。TDZ可以促进愈伤组织的诱导, 只添加3.00 mg·L-1NAA的培养基中, 叶片多数分化出根, 愈伤组织诱导率仅为4.67%;同时添加0.50~1.00 mg·L-1TDZ可以显着提高愈伤组织的诱导率 (P<0.05) , TDZ质量浓度为0.50 mg·L-1时诱导率最高, 为66.82% (表1) 。
新生的愈伤组织通常有2种形态, 一种是淡黄色透明型, 一种为白色致密型;有研究认为, 淡黄色透明状愈伤组织更有利于分化[6]。本研究发现, 在添加0.30mg·L-16-BA和1.00 mg·L-1 2, 4-D的培养基中, 叶片边缘多产生块状的淡黄色透明愈伤组织, 体积大, 生长快 (图1A, 图1B) ;而在添加0.30 mg·L-16-BA和2.00~4.00mg·L-12, 4-D, 3.00 mg·L-1NAA和0.50~1.00 mg·L-1TDZ的培养基中叶片边缘多产生白色致密愈伤组织, 体积小, 生长慢。这说明添加0.30 mg·L-16-BA和1.00 mg·L-1 2, 4-D的培养基对诱导伴矿景天叶片愈伤组织的质量更佳。
表1 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响
2.2、不同质量浓度的6-BA对愈伤组织分化的影响
增殖培养20 d后, 挑选淡黄色透明状愈伤组织转接于分化培养基上。观察发现愈伤组织在光下逐渐由淡黄色变成绿色, 表面长出突起, 逐渐形成黄绿色的芽丛 (图l C, 图1D) 。未添加6-BA, 只添加0.10mg·L-12, 4-D的培养基中, 愈伤组织不能分化 (表2) ;随着6-BA质量浓度的升高, 愈伤组织分化率也升高, 6-BA质量浓度为1.00 mg·L-1和2.00 mg·L-1时分化率为27.44%和21.85%, 两者无显着差异。6-BA的质量浓度影响愈伤组织的分化, 伴矿景天愈伤组织分化最佳培养基为1.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-12, 4-D。
表2 不同质量浓度的6-BA对愈伤组织分化的影响
2.3、不同质量浓度6-BA对不定芽增殖的影响
出芽的愈伤组织转接于增殖培养基中, 添加0.10 mg·L-12, 4-D和不同质量浓度 (0.50, 1.00 mg·L-1) 6-BA。培养30 d后, 芽丛膨大, 2种培养基中, 不定芽的繁殖系数都在8.0以上;6-BA质量浓度为0.50 mg·L-1时, 芽生长健壮、叶片鲜绿 (图1E) , 6-BA质量浓度为1.00 mg·L-1时增殖效果更加明显, 但是芽细小, 生长较弱 (图1F) 。因此, 伴矿景天最佳不定芽增殖培养基为0.10 mg·L-12, 4-D+0.50 mg·L-16-BA。
2.4、IBA对伴矿景天生根的影响
伴矿景天易生根, 在添加不同质量浓度 (0, 0.10, 0.50, 1.00, 2.00 mg·L-1) IBA的培养基中根诱导率都能达100%, 但影响根和植株的生长状态。在添加1.00, 2.00 mg·L-1IBA的培养基中, 根较粗壮, 植株生长快且健壮 (图1G, 图1H) ;在IBA质量浓度小于0.50 mg·L-1的培养基中, 根较细小, 植株矮小, 生长势差。添加1.00~2.00 mg·L-1IBA的培养基是适宜伴矿景天愈伤组织的生根培养基 (图1I) 。
3、结论与讨论
本研究以伴矿景天幼嫩叶片为外植体, 以添加了300 mg·L-1水解酪蛋白的MS培养基为基本培养基, 研究不同植物生长调节剂组合对伴矿景天愈伤组织诱导及分化的影响, 建立其再生体系。结果表明:添加1.00~2.00 mg·L-12, 4-D和0.30 mg·L-16-BA的培养基对愈伤组织诱导效果最佳, 诱导率为92.01%;添加0.10 mg·L-1 2, 4-D和1.00 mg·L-1 6-BA对愈伤组织分化效果最佳, 分化率为27.44%。添加0.10 mg·L-12, 4-D和0.50~1.00 mg·L-1 6-BA最适宜芽增殖;添加1.00~2.00 mg·L-1IBA最适宜生根。
植物的不同器官在组织培养过程中诱导形成愈伤组织的难易程度存在差异[6]。本研究也尝试用幼嫩茎段作为外植体, 在添加0.30 mg·L-16-BA和1.00~4.00 mg·L-1 2, 4-D的培养基中生长时比叶片更易被诱导出愈伤组织。但是茎段消毒不如叶片彻底, 污染率较高, 茎段材料相对较少;同时茎段在培养基中不如叶片膨大生长得快, 愈伤组织的产生量比叶片少很多。
图1 伴矿景天叶片愈伤组织的诱导及植株再生
植物生长调节剂在植物可塑性发育中起着很直接和非常重要的作用[7]。伴矿景天叶片在添加较高质量浓度 (1.00~4.00 mg·L-1) 的生长素培养基中被诱导形成愈伤组织, 愈伤组织在添加较高质量浓度 (1.00~2.00 mg·L-1) 的细胞分裂素培养基中分化出不定芽。这与刘勇军等[8]对东南景天Sedum alfredii组织培养的研究结果一致。1.00~4.00 mg·L-12, 4-D均可高效诱导愈伤组织发生 (诱导率>81.58%) , 但质量浓度为2.00和4.00 mg·L-1时愈伤组织质量差, 多呈现白色致密的形态, 生长慢, 不易分化;当质量浓度为1.00 mg·L-1时, 愈伤组织多为淡黄色透明状, 生长快, 愈伤组织较易分化。这可能是因为2, 4-D对植物细胞有一定的毒害作用[9]。只添加3.00 mg·L-1NAA的培养基对叶片愈伤组织诱导率仅为4.67%, 添加0.50~1.00 mg·L-1TDZ可以显着提高愈伤组织的诱导率 (>46.74%) , 与李焕秀等[10]发现外源TDZ能诱导黄芩Scutellaria baicalensis外植体幼茎、子叶柄和下胚轴产生愈伤组织的结果一致。
暗培养处理可以促进不定芽的再生[11-14], 其原因可能是暗培养条件会减缓生长素的降解过程, 有助于调节外植体内生长素和细胞分裂素的比例, 从而有助于愈伤组织的器官形成[15]。本研究中分化实验并未进行暗处理, 在添加1.00 mg·L-16-BA和0.10 mg·L-1 2, 4-D的培养基中分化率最高, 为27.44%。另外, 本研究尝试将愈伤组织接种于添加0.10 mg·L-12, 4-D和2.00 mg·L-1玉米素 (ZT) 的分化培养基中, 光下培养30 d, 结果发现分化率小于5.00%;将其转到暗处培养, 分化率达17.00%。这说明暗培养同样可以促进伴矿景天愈伤组织的分化。因此, 今后将研究暗培养条件下6-BA, ZT, TDZ等外源植物生长调节剂对愈伤组织分化的影响, 以期提高分化率。
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