大草履虫基因组DNA提取的最佳方法筛取

动物学论文 2019-09-21 点击：

　　大草履虫(Paramecium caudatum)是一种较为常见的原生动物,身体呈圆筒形,前端较圆,中后部较宽,后端较尖,外形很像一只倒放着的草鞋,所以被称作草履虫. 大草履虫因为其个体较大,结构典型、繁殖快、观察方便、容易采集培养等特点,常被作为研究细胞遗传的好材料[1]. 目前,国内外对于其生活及生理特性的研究已屡见不鲜. 且多年来,遗传学家已经用它研究细胞质遗传、细胞质和细胞核在遗传中的相互作用,以及细胞类型的转变等,取得不少科学成果.

　　运用分子生物学技术,从DNA水平研究大草履虫,可以阐明种间亲缘关系和物种起源,有助于基因文库构建和序列分析等. 快速高效地提取高质量的DNA,为草履虫亲缘关系研究、基因组比较、遗传多样性和某些特定基因的标记等后续的分子生物学研究提供参考.尤其在进行群体遗传学研究中需要的研究样本量大,除了对DNA的质量和数量有要求外,还需要方法简便易行. 本试验分别采用SDS法、CTABⅠ法和CTABⅡ法[2-4]对大草履虫进行基因组DNA的提取,从中筛选出合适的方法,并逐步完善,以便能够快速稳定地获得大草履虫的基因组DNA.

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　实验室提供的大草履虫纯培养液,约950只/ mL.取大草履虫培养液20 mL,置于2个10 mL离心管中,5 000 r/min离心5 min.弃去上清液保留大草履虫沉淀,用无菌水离心洗涤2次,合并沉淀,作为试验材料.

　　1.2 仪器设备

　　PHS-4CT型精密pH计、高压灭菌锅、TG16-WC型台式高速离心机、SHH-W21-4203用电热恒温水浴锅、微量移液器、紫外分光光度计(BECKMAN COULTER)、DYY-6C型电泳仪、Tamon 1600凝胶成像系统等.

　　1.3 主要药品及试剂

　　DNA Marker、Tris碱、浓HCl、乙酸、CTAB、β-巯基乙醇、EDTA、SDS、琼脂糖、溴化乙锭(EB)、氯仿、异戊醇、饱和酚、无水乙醇、冰醋酸、氯化钠(NaCl)、醋酸钠(NaAc)等(试剂均为分析纯);SDS裂解液:150 mmol /L NaCl、2% SDS、50 mmol/L EDTA、20 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0;CTABⅠ裂解液:100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl、4%CTAB、0.2% β-巯基乙醇(现配现用)、pH8.0;CTABⅡ缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L EDTA、0.14 mol/L NaCl、2% β-巯基乙醇(现配现用)、pH 8.0;CTABⅡ裂解液:100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、3% CTAB、1% β-巯基乙醇(现配先用)、pH 8.0;TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH 8.0;TAE电泳液:0.04 mol/L Tris-HAc、0.002 mol/L EDTA、pH 8.0.

　　1.4 大草履虫的DNA提取

　　1.4.1 3种方法粗提比较

　　(1)传统SDS法

　　(2)CTABⅠ法[3]

　　①裂解.向草履虫沉淀中加入1.5 mL CTABⅠ裂解液,混匀,60 ℃水浴30~40 min;
②其余步骤同传统SDS法.

　　(3)CTABⅡ法[4]

　　① 向草履虫沉淀中加入冰浴的CTABⅡ缓冲液1.5 mL混匀,冰浴10 min,在4 ℃,5 000 r/min下离心10 min,收集沉淀;
    ② 裂解.在沉淀中加入60 ℃预热CTABⅡ裂解液1.5 mL混匀,65 ℃水浴30~40 min,中间轻柔振荡3次,放气1次;
    ③在溶液中加入5 mol/L KAc 1.5 mL混匀,冰浴20 min;
    ④氯仿/异戊醇抽提.加入1.5 mL氯仿/异戊醇轻柔颠倒混匀,乳化10 min,于室温下,11 000 r/min下离心10 min,吸取上清液,转入10 mL新离心管中;氯仿/异戊醇重复抽提一次.
    ⑤沉淀、洗涤、溶解等步骤同传统SDS法.

　　1.4.2 改进SDS法

　　(1)SDS-蛋白酶K法[5-6]①裂解.向草履虫沉淀中加入1.5 mL 60 ℃预热SDS裂解液及12 μL蛋白酶K,混匀,60 ℃水浴30~40min;②在沉淀DNA时,取上清液于5 mL的离心管中,加入2倍的预冷无水乙醇及0.5 mL NaAc,混匀,冰浴20 min,11 000 r/min离心5 min;其余步骤同传统SDS法.

　　(2)SDS-NaAC法[7]①裂解.向草履虫沉淀中加入1.5 mL 60 ℃预热SDS裂解液及1.5 mLNaAc,混匀,60 ℃水浴30~40 min;②在沉淀DNA时,取上清液于5 mL的离心管中,加入2倍的预冷无水乙醇及0.5 mL NaAc,混匀,冰浴20 min,11 000 r/min离心5 min;其余步骤同传统SDS法.

　　1.4.3 对比验证SDS-NaAc法和不加NaAc的对照SDS法

　　不加NaAc的对照SDS法,步骤同SDS-NaAc法,只是裂解时不加NaAc.

　　1.5 DNA纯度和完整性检测[8-10]

　　①紫外分光比色检测. 将不同方法提取的大草履虫DNA样品经TE缓冲液稀释10倍,测定在260 nm和280 nm的OD值,并记录试验结果;
②琼脂糖凝胶电泳检测. 电压150 V,电流250 mA,用1%琼脂糖凝胶室温下电泳1 h检测提取的DNA,EB染色,凝胶成像系统拍照.

　　2 结果及分析

　　2.1 紫外分光比色检测

　　DNA在260 nm有最佳吸收值,蛋白质在280 nm有最佳吸收值,OD260 nm/OD280 nm值在1.6~1.9之间为最佳,DNA纯度较高.而低于1.6则表示含有蛋白质等杂质污染,高于1.9则表示含有RNA污染[8,11-12]。

比较传统SDS法、CTABI和传统CTABII法提取DNA的比色实验结果(见表1)发现:3种方法提取的DNA的OD260 nm/OD280 nm值均小于1.6,即纯度均不高,都含有不同程度的蛋白质等杂质污染.但3种方法中SDS法所提DNA纯度明显高于其他两种方法,所以传统SDS法较适合于大草履虫的DNA提取,只需要进一步改良SDS法即可.

　　考虑蛋白质是影响DNA纯度的主要因素,故在原有传统SDS法基础上,进行2种改良,即分别加入蛋白酶K和NaAc,并在原有步骤上多进行一步酚/氯仿/异戊醇抽提来去除其他杂质.实验结果(见表2)发现,2种实验方法所提DNA样品的OD260 nm/OD280 nm值都大于1.9,含有微量RNA污染,但蛋白质和多糖等杂质去除较干净,DNA较纯.说明实验思路正确,但在实验操作规范的情况下,两种方法所提DNA样品纯度和得率差别不大,所以在快速提取大草履虫DNA时没必要使用昂贵的蛋白酶K来去除蛋白质.

　　为了验证NaAc去除蛋白质的实验效果,又进一步比较加入NaAc和不加NaAc的对比试验.通过实验结果(见表3)可发现:SDS-NaAc法所得DNA样品在260 nm的吸光值为0.264,属于0.2~2.0的最佳范围,且得率较大,而对照SDS法则较少,故SDS-NaAc法适于大草履虫DNA提取.

　　2.2 琼脂糖凝胶电泳检测

　　不同实验方法所提取DNA样品经过1%琼脂糖凝胶电泳,根据电泳图可知DNA的完整性. 通过3种方法粗提DNA凝胶电泳结果(见图1)可发现:传统SDS法所提取的DNA样品的电泳条带较整齐、完整性和浓度都较高,CTAB I法提取的DNA 样品有杂质,而CTAB II法所得DNA在电泳时几乎检测不到. 通过电泳图也可知SDS法较适于大草履虫的DNA提取. SDS-蛋白酶K法及SDS-NaAc法电泳结果见图2,发现:2种方法所提DNA样品的电泳条带较整齐、完整性和浓度都较高.SDS-NaAc法及对照SDS法电泳结果见图3. 可见:2种方法所得DNA的完整性都较好,但SDS-NaAc法所得DNA得率较大,利于后续试验的进行,而对照SDS法则得率小.

　　因此,在大草履虫基因组DNA的提取中,首先,加入表面活性剂SDS裂解大草履虫,使蛋白质变性,形成蛋白质-SDS复合物,释放出核酸.在裂解同时加入高浓度的NaAc,利用高浓度的NaAc会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀的原理,通过离心处理,便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-SDS及RNA等以复合物的形式分离开,从而使DNA得到纯化[7]. 经简单常规抽提除杂,在沉淀DNA时加入低浓度NaAc,经SDS作用,低浓度NaAc能够很好地促进DNA的沉淀,后经乙醇洗涤沉淀,便可获得较高纯度和浓度的大草履虫DNA.

　　3 结论

　　大草履虫作为单细胞原生动物的典型代表,其细胞内所含的大量蛋白质,是影响DNA纯度的主要因素.SDS和CTAB虽然都能很好地裂解大草履虫,但SDS能很好地使蛋白质变性,形成蛋白质-SDS复合物,释放出核酸;而CTAB则对多糖、酚等杂质有很好地去除效果.正如试验第一阶段所体现:传统SDS法所提的DNA无论是质还是量都高于CTAB I 和CTABII法.在第二阶段的改进实验中,发现加入NaAc和蛋白酶K都能够很好地去除大草履虫细胞中的蛋白质,而且NaAc价格便宜,故不必使用昂贵的蛋白酶K去除蛋白质杂质.在最后一阶段中,SDS-NaAc的效果明显体现出来,不仅提取DNA的得率高,而且OD260 nm值也较好,能够用于进一步的分子试验.

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