关键词:微生物学;设计性实验;创新能力
1 引 言微生物学是研究微生物及其生命活动规律的科学,是一门实践性和应用性很强的学科。实验教学是微生物学课程教学的重要环节,通过实验教学不仅可以加深学生对课堂理论知识的理解,而且也是培养学生观察能力、操作能力、思维能力的重要途径,更是培养学生创新能力和实践能力的一个重要手段。创新能力培养是高校教育的根本目的,“创新是一个民族进步的灵魂,是国家兴旺发达的不竭动力。”加强创新能力培养是全面贯彻国家教育方针的需要,从高校培养学生的过程来看,创新能力的培养贯穿于教育教学的全过程。但归结起来,又主要存在于理论教学与实践教学两大环节。从培养创新能力的角度看,实践教学的作用更大于理论教学,而作为实践教学重要环节的实验教学,对创造性思维和创新能力的培养起着更为重要的作用。
高等院校的传统微生物学实验主要以独立的、小型的验证性实验为主,学生按照实验指导书上的实验步骤,机械地完成实验任务,这削弱了学生的学习兴趣,没有真正达到实验教学的目的,不利于学生动手能力和创新能力的培养,不符合高等教育人才培养的要求。针对传统微生物学实验教学中存在的不足,结合本专业微生物学实验室的仪器设备和教师的科研项目,我们有针对性地开展了微生物学设计性实验项目的探索———凝结芽孢杆菌TBC-169的发酵培养。
2 实验目的、基本原理和材料(1)实验目的。通过实验使学生观察细菌个体形态及菌落特征,掌握革兰氏染色的原理和方法,学习芽孢染色的方法。掌握培养基的配制原理、配制程序、配制方法及高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。学习并掌握微生物的分离和纯化技术,了解4大类微生物的培养条件。了解小型发酵罐的基本结构和发酵的基本过程,学习并掌握发酵罐的使用方法。 实 验 室 研 究 与 探 索第29卷(2)基本原理。参考《微生物学实验教程》。
(3)实验材料。爽舒宝———口服凝结芽孢杆菌活菌片(青岛东海药业有限公司);微生物实验室各种药品和仪器。
3 实验内容学生首先配制培养基,然后从爽舒宝中分离、纯化出凝结芽孢杆菌单克隆菌落,观察菌落形态特征,并进行革兰氏染色和芽孢染色。最后,探索凝结芽孢杆菌批量培养优化条件和发酵培养优化条件以获得高浓度凝结芽孢杆菌菌液。
4 实验过程与结果4. 1 购买药品、配制培养基教师购买青岛东海药业有限公司生产的“爽舒宝———口服凝结芽孢杆菌活菌片”,为学生下一步实验做准备。学生分组查阅文献,在课堂上经过讨论修改后确定凝结芽孢杆菌培养基和培养条件。凝结芽孢杆菌基础培养基:酵母膏10 g/L,蛋白胨10 g/L,MgSO4·7 H2O 1. 0 g/L, K2HPO41. 2 g/L, NaH2PO41. 0g/L,葡萄糖5 g/L, pH 7. 5, 121℃灭菌20 min。培养条件:恒温摇床培养,温度37℃,转速200 r/min,培养时间48 h。
4. 2 凝结芽孢杆菌的分离、纯化和染色学生采用稀释倒平板法和涂布法从爽舒宝中分离纯化得到凝结芽孢杆菌的单克隆菌落,观察单克隆菌落形态特征,并进行革兰氏染色和芽孢染色。凝结芽孢杆菌的菌落形态观察结果见表1,革兰氏染色呈现阳性,芽孢染色结果见图1。
凝结芽孢杆菌(TBC-169)菌落形态观察形状大小气味光泽颜色透明度湿润程度与培养基结合程度边缘不整齐,圆形较大酸味无乳黄色不透明湿润不紧密图凝结芽孢杆菌芽孢染色结果(OLYMPUS CX21 1000×)4. 3 探索批量培养优化条件根据微生物学实验课的学时和进度安排,本次实验要求学生重点探索不同碳源(二碳、三碳、六碳)和锰离子、钙离子对凝结芽孢杆菌生长情况和产芽孢的影响。
(1)葡萄糖对凝结芽孢杆菌生长的影响。第1组学生负责不同浓度葡萄糖作为碳源对凝结芽孢杆菌生长的影响。学生经过查阅文献讨论确定的实验方案为:考察葡萄糖浓度为0、5和10 g/L对凝结芽孢杆菌生长的影响。实验结果如下:图2显示, 0~27 h, 10g/L的葡萄糖最适合凝结芽孢杆菌的快速生长, 27 h时菌体浓度达到最高,此时OD680 nm为5. 26,随后菌体浓度降低并保持在3. 00左右,实验结束测定其pH=4. 49,学生讨论分析的原因是pH过低抑制菌体生长,从而导致实验后期菌体浓度下降。5 g/L的实验组在27~51 h时菌体浓度先降低后升高,实验结束测定其pH为7. 86,分析原因是菌体利用完葡萄糖后,开始利用酵母膏和蛋白胨作为第二碳源进行二次生长,或者是由于学生轮流进行实验,造成的操作误差。
葡萄糖对凝结芽孢杆菌生长的影响(2)甘油对凝结芽孢杆菌生长的影响。第2组学生负责不同浓度甘油作为碳源对凝结芽孢杆菌生长的影响。学生经查阅文献讨论确定的实验方案为:考察甘油浓度为0、5和10 g/L对凝结芽孢杆菌生长的影响。实验结果如图3所示: 0~40 h, 10 g/L的甘油最适合凝结芽孢杆菌的快速生长, 40 h时OD680 nm达到最大为6. 20,随后菌体浓度下降,实验结束测定其pH为4. 70,学生经讨论分析认为pH降低和培养基中营养物质消耗殆尽是实验后期菌体浓度降低的原因。
(3)乙醇对凝结芽孢杆菌生长的影响。第3组学生负责不同浓度乙醇作为碳源对凝结芽孢杆菌生长的影响。学生经过查阅文献讨论确定的实验方案为:考察乙醇浓度为0、5和10 g/L对凝结芽孢杆菌生长的影响。实验结果如下:从图4可以看出,与对照组相比,实验初始阶段,乙醇没有促进凝结芽孢杆菌的生长。学生分析原因认为是实验初期菌体处于生长延滞期,菌体浓度较低,乙醇浓度相对较高,高浓度乙醇对100 第12期吕 乐,等:微生物学设计性实验教学探讨菌体有毒害作用,抑制其生长;实验后期菌体渡过延滞期进入对数生长期, 10 g/L乙醇最适合凝结芽孢杆菌的快速生长, 40 h时OD680 nm达到最大为3. 92。
甘油对凝结芽孢杆菌生长的影响图4 乙醇对凝结芽孢杆菌生长的影响(4)锰离子、钙离子对凝结芽孢杆菌产芽孢的影响。第4组学生负责不同浓度的锰离子、钙离子对凝结芽孢杆菌产芽孢作用的影响,学生经过查阅文献讨论确定的实验方案为:考察Mn2+和Ca2+浓度为0、50和100 mg/L对凝结芽孢杆菌产芽孢的影响。实验结果如下:图5、6显示,与对照组相比,达到相同的生物量,添加锰离子和钙离子均使凝结芽孢杆菌的生长时间从27 h缩短到15 h。
Mn2+对凝结芽孢杆菌生长的影响(5)实验小结,讨论确定发酵培养条件。通过上述实验,学生讨论分析得出: 10 g/L的实验组菌体生长情况均优于5 g/L。0~27 h,葡萄糖为10 g/L的实验组菌体生长速度最快,菌体浓度也较高,但在27 h后,由于产酸较多, pH下降,导致菌体浓度降低。甘油作为碳源在实验后期可以达到更高的菌体浓度,但图6 Ca2+对凝结芽孢杆菌生长的影响所需时间较长。乙醇作为碳源,菌体的生长速度和生物量都低于葡萄糖。达到相同的生物量,锰离子和钙离子均能够缩短凝结芽孢杆菌的生长时间。综合考虑批量培养实验结果,采用10 g/L的葡萄糖作为碳源进行发酵培养,锰离子和钙离子作用基本相同,本着经济节约,发酵培养我们选择氯化钙。
4. 4 探索发酵培养优化条件依据批量培养实验结果,学生讨论确定的发酵培养条件如下:发酵培养基为葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,蛋白胨10 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,KH2PO42.0 g/L,Na2CO32.0 g/L,CaCl2277.5mg/L。流加液:葡萄糖1000g,酵母膏200 g,H2O 1.7 L,1~6 h,1.0 g/(L·h);6~12h,2.0 g/(L·h);12 h后,4.0 g/(L·h)。培养条件:体积20 L,温度37℃,曝气2m3/L,初始转速200 r/min,每4 h提高100 r/min,最终达到500 r/min,培养时间24 h,流加1.0mol/LNaOH溶液调节pH为7.0。
学生依据发酵培养实验结果讨论分析得出, 0~6 h为凝结芽孢杆菌生长延滞期,此时菌体生长缓慢; 6~22 h为对数生长期,菌体快速增长,菌体浓度在22 h达到最高,此时OD680 nm为40. 80; 22~24hOD680 nm逐渐下降,菌体进入稳定期,此时收获可以获得高浓度的凝结芽孢杆菌菌体和芽孢。整个补料发酵培养过程中,葡萄糖残留量始终维持在10~20 g之间,满足菌体快速生长的需要。发酵结束后,加热发酵液至70℃,使凝结芽孢杆菌菌体转变为芽孢。发酵液经喷雾干燥后制作成胶囊,如图8所示。
自制凝结芽孢杆菌胶囊油、乙醇作为碳源对凝结芽孢杆菌生长的影响,结果发现10 g/L的葡萄糖在最短的培养时间内获得了较高的生物量,为最佳碳源。甘油虽然能获得最大的生物量但所需培养时间较长,乙醇则不适宜作为凝结芽孢杆菌生长的碳源。此外,我们还探索了锰离子和钙离子对凝结芽孢杆菌产芽孢作用的影响,结果表明达到相同的生物量,添加锰离子和钙离子均能够缩短凝结芽孢杆菌的生长时间。依据批量培养实验结果分析讨论确定了发酵培养条件,在补料发酵培养过程中,我们在24 h获得了OD680 nm高达40.80的生物量,发酵培养获得成功。
学生自主设计,教师指导的微生物学设计性实验“凝结芽孢杆菌TBC-169的发酵培养”具有一定的基础性和探究性[11],体现出以基本实验技能为基础、以创新能力培养为重点的实验教学体系,与学生以后的科学研究和工作联系紧密。学生在实验过程中,不仅对培养基的配制与灭菌、菌种的分离与纯化、细菌的形态观察与染色、微生物的培养条件控制等微生物学的基本实验操作进行了反复训练和强化,规范了实验操作,而且学生通过亲自查阅文献,分析讨论实验中遇到的各种问题,激发了探索研究的兴趣,培养了严谨的科研态度。虽然开设微生物学设计性实验对于培养学生创新能力和实践能力的优势明显,但在实验过程中也存在一些问题。如微生物学设计性实验是一个连续性的实验操作过程,所需时间较长,由于时间安排上不够完善,对实验结果造成一定影响;实验室条件和仪器设备的数量以及实验经费的充足与否也会对设计性实验的预期目标有一定的制约,如何使微生物学实验教学更加适应高等教育人才培养的要求,我们还需要进一步的探索和实践。
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