关键词: 苏云金芽胞杆菌; aiiA 基因; 生物信息学分析; 生理生化; 杀虫晶体蛋白
苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis，简称Bt) 是一种常见的土生细菌，在芽胞形成过程中会产生伴胞晶体，对某些昆虫、螨类、动植物寄生线虫以及原生动物具有胃肠毒性。Bt 所产生的杀虫晶体蛋白( insecticidal crystal proteins，简称ICPs) 被广泛应用于农林业的生物防治之中，是当前最有发展潜力的生物农药之一。已有数据表明 Bt 可对 16 个目 3 000 多种害虫有效。随着人们对生物防治的广泛重视以及分子生物学和分子遗传学的迅速发展，自 20 世纪 80 年代以来，Bt的研究十分活跃，科学家们在 Bt 资源的发掘、杀虫晶体蛋白基因的定位、分离和克隆、结构功能及其生产应用等方面进行了深入的研究，Bt 微生物农药制剂作为我国的绿色食品生产和出口做出了积极贡献。Bt 杀虫剂已成为世界上应用最广泛的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的90% ～ 95% 。它不仅克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，而且还具有选择性强、安全、原料简单等优点。
然而，不同 Bt 亚种的杀虫能力及其培养特性都存在着一定的差异，应用生理生化、药敏性、PCR 等分子生物学的方法和技术是鉴定 Bt 的主要方法，对有效菌株的选择以及高毒力或特异性菌株的选育具有十分重要的意义，但只采取一种或其中几种鉴定方法会造成一定误差，导致鉴定结果不准确，这就需要一种系统的鉴定体系从各个方面对供试菌种进行鉴定，同时为菌种投入生产提供资料。由于 ICPs 种类有限，长期应用也对某些特定害虫形成选择压力，例如世界性蔬菜害虫小菜蛾在田间对 Bt 产生了抗性。与此同时，Bt 中的营养期杀虫蛋白( vegetative insecticidal proteins，简称VIPs) 的杀虫谱较窄且仅对鳞翅目昆虫效果明显;几丁质酶本身没有杀虫活性，只是起到增效剂的作用。并且 Bt 通常不能产生细菌、真菌等敏感的抗生素所以较难被应用于疾病防治。若能致力于把 Bt 应用领域拓宽，大力开发成防治细菌和真菌病害的微生物工程菌制剂，这将成为一个崭新的突破口。因此，从自然界中拓展新资源，筛选新的高效菌株以实现生产菌株的交替和提供后备资源，并挖掘新的抗病基因或抗病系统就成了一项刻不容缓的任务。
随着科学的不断发展，研究者通过对病原细菌之间存在着能依靠细胞密度来控制细菌行为的发现，将这一细菌群体新特性称为群体感应( quo-rum-sensing，简称 QS) 系统或细胞群体浓度依赖( cel1-density-dependent) 系统。其中的 N-乙酰高丝氨酸内酯( N-acylhomoserine lactones，AHLs)作为一种革兰氏阴性细菌 QS 系统中极为关键的信号分子，能够活化或抑制目标基因从而改变细胞的生理特性。由细菌自身合成或分泌的 AHLs分子可自由穿透细菌的细胞壁和细胞膜。在这种自由交流过程中病原菌可感知外界环境中与其他细菌数量的差异情况，当所累积的AHLs 分子浓度达到一定阈值时，便可调控其致病基因的表达，如可诱导调控胡萝卜软腐欧文氏菌( Erwinia carotovora) 、费氏弧菌( Vibrio fisheri)和铜绿假单胞菌( P． Aeruginosa) 等许多病原菌中致病基因的表达。
绿色 Bt 产业开始渐渐被越来越多的人所重视，对该菌的研究也从传统生物学研究深入到了分子生物学水平。近年来研究发现，在苏云金芽胞杆菌中广泛存在着能降解 AHLs 分子的胞内解酯酶 AiiA 蛋白。通过该类蛋白水解AHLs 分子内酯键从而降低了 AHLs 分子的浓度，进而抑制某些胞外酶的表达，影响革兰氏阴性细菌的群体感应系统，削弱细菌的致病性，最终使得 AHLs 分子的效力大幅度减小。由此可知，胞外分泌性蛋白 AiiA 对于苏云金芽胞杆菌存在极大的辅助作用，并能有效地提高某些植株的抗病性。本研究利用对已报道的 aiiA 基因的核苷酸序列同源性设计一对简并引物，从实验室分离保藏的菌株中克隆出 1 株苏云金芽胞杆菌的aiiA 基因，并对具有代表性的 BRC-PC6-aiiA 基因进行生物信息学分析和预测，以期为揭示 AiiA 在Bt 中的功能提供参考以及对 Bt 进一步开发应用打下基础。LB 培养基: 胰蛋白胨 10 g / L，酵母提取物 5g / L，氯化钠 10 g / L，用 NaOH 调至 pH 7． 2，15 磅灭菌 20 min，室温保存。固体培养基加入琼脂粉10 g / L。将供试菌株按 1%接种至液体 LB 培养基中，30℃ 、180 r / min 摇床活化过夜。6 000 r / min 离心获取菌体，并用无菌水清洗 3 次，制成菌悬液。菌悬液储存于 4℃备用。使用试剂板( 合肥恒星科技开发有限公司)对菌株的生理生化指标以及药敏反应进行测定，具体步骤为: 挑取单菌落于5 mL 无菌生理盐水中制成 0． 5 麦氏单位的混悬液( A 管) ，从中吸取0. 1 mL，加入 10 mL 无菌盐水中混匀( B 管) 。A、B 两管分别倒入经灭菌的 V 形槽内，制备成 A液、B 液。将 A、B 液分别加入试剂板中，每孔0． 1 mL。盖好试剂板，置于 35℃ 培养箱培养24 ～ 48 h。使用 HX-21 细菌鉴定药敏分析仪的分析系统软件分析试剂板上的信息并记录为阴阳性结果。分别提取 BRC-PC6 和 HD-1 菌株的晶体蛋白，SDS-PAGE 分析显示，供试菌株 BRC-PC6 的杀虫晶体蛋白与 HD-1 具有很高的相似性，均以产生 135 kDa 和65 kDa 两种蛋白为主，因而推断可能具有共同的杀虫谱及杀虫活性( 图 2，彩图见封三图版) 。
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